Шитье и кройка ДНК стали точнее

Про технологию CRISPR/Cas — эдакие универсальные геномные ножницы — в последние годы сказано очень много. Эта технология действительно произвела революцию и позволила существенно расширить возможности молекулярной биологии. Метод позволил без особых усилий редактировать в лаборатории практически любую ДНК: разрезать ее в нужных местах и при надобности заменять отдельные участки на другие, получая на выходе генетически модифицированный организм с заданными свойствами.

По идее, эта технология могла бы помочь в будущем не только создавать ГМО животных и растений, но и помочь людям с генетическими заболеваниями. Попытки уже ведутся, но результаты пока не опубликованы. Методика была опробована на пациентах с серповидно-клеточной анемией, бета-талассемией и раком пищевода; кроме того, известно о единственном случае редактирования человеческих эмбрионов (в Китае). Этот случай вызвал волну негодования и споров в научных кругах: эксперимент был поставлен «на коленке» и — судя по обрывкам просочившейся информации — не удался.

Технология CRISPR/Cas далека от совершенства. Метод не всегда срабатывает правильно, и особенно часто сбои происходят в человеческих клетках. Эксперименты на клеточных линиях говорят о том, что правильное редактирование происходит лишь в 3–20% случаев.

Основные проблемы начинаются на стадии «зашивания» ДНК. CRISPR/Cas без труда удается сделать разрез в заданном месте, но дальше метод полагается на то, что клетка сама этот разрез «залатает» по образцу, предоставленному учеными. В зависимости от характера разреза клетка использует разные системы починки, отличающиеся по аккуратности. CRISPR/Cas разрезает обе нити ДНК, и за подобные починки отвечает самая неряшливая система репарации.

Дэвид Лю, профессор Гарвардского университета, один из авторов нового метода редактирования генома
Дэвид Лю, профессор Гарвардского университета, один из авторов нового метода редактирования генома. ted.com

Два года назад команда исследователей под руководством биохимика Дэвида Лю (David Liu), зав. лабораторией в частном научно-исследовательском Институте Броада (Кембридж, штат Массачусетс) и профессора Гарвардского университета, придумали вариант CRISPR/Cas, который позволяет не резать обе цепочки ДНК, а надрезать одну из двух и самостоятельно чинить этот надрез. Основной фермент, который проводил все операции, состоял из двух кусков: вместе оказались сшиты мутантный белок Cas9, способный разрезать одну цепь ДНК в нужном месте, и фермент, аккуратно модифицирующий «буквы» ДНК. К сожалению, у нового способа было явное ограничение — он мог заменить всего одну «букву» ДНК-кода, а более крупные изменения оказались невозможны.

Недавно авторы этого метода выпустили статью [1], в которой предложили усовершенствованную версию метода: теперь стало возможным аккуратно менять любое количество «букв» подряд. Хитрость заключается в использовании нового гибридного фермента. Как и в предыдущем случае, одна из его половинок состоит из мутантного белка Cas9. Вторая часть состоит из обратной транскриптазы — фермента, который умеет синтезировать ДНК по матрице РНК.

Всю работу нового редактора можно разбить на несколько ­ступеней (рис. 1).

Рис. 1 Алгоритм работы нового редактора генома (nature.com/articles/d41586-019-03164-5)
Рис. 1 Алгоритм работы нового редактора генома (nature.com/articles/d41586-019-03164-5)
  1. Геномный редактор находит нужный участок ДНК и делает надрез в ­заданной точке.
  2. С одной стороны надреза происходит наращивание цепи «правильной» последовательностью.
  3. Старый кусок ДНК вытесняется новой последовательностью.
  4. На второй цепи ДНК — до этого нетронутой (интактной) — ­делается надрез напротив измененного куска.
  5. Клеточная система починки ДНК распознает его и чинит по ­образцу уже исправленной цепи.

Для работы нового редактора требуется не только фермент — машинка для резки и синтеза ДНК, — но и лекало, по образцу которого будут проводиться эти изменения. В его роли выступает единая молекула РНК, содержащая последовательности, комплементарные исходной и требуемой последовательности, а также участок, который связывается с ферментом. Для классической системы CRISPR/Cas тоже нужны образцы последовательностей исходника и результата, но там они устроены немного по-другому и лежат на разных молекулах.

За счет своей похожести РНК может находить участок ДНК, который нужно изменить и связываться с ним, образуя комплекс РНК-ДНК. В таком виде ее находит фермент, связывается и делает надрез в ДНК.

Ферменты синтеза ДНК не умеют делать ее «просто так», для работы им требуются хвост уже существующей молекулы, который они смогут достраивать, и образец — комплементарная цепь. Свободный хвост ДНК появляется из-за надреза, а в качестве образца фермент использует кусок РНК с внесенными изменениями. Таким образом, от последовательности молекулы РНК целиком зависит то, где и какие изменения будут сделаны, а фермент является универсальным исполнителем.

Важно, что и лекало, и фермент изначально расположены близко к редактируемому участку, оперативно включаются в синтез и контролируют его. Это снижает вероятность вмешательства других случайных клеточных ферментов и увеличивает предсказуемость результата.

В итоге работы гибридного фермента редактируемый кусок выглядит следующим образом. Одна цепь по-прежнему остается нетронутой, а вторая надрезана и достроена так, что у изменяемого куска есть две версии — старая и новая. Они частично совпадают, так что комплементарная цепь может взаимодействовать с обеими.

Следующая задача исследователей — сделать так, чтобы интродуцированный кусок последовательности закрепился в ДНК: вытеснил старую последовательность на той же цепи и изменил под себя вторую комплементарную цепь. Частично решение этих задач возложено на собственные ресурсы клетки, но всё равно не пускается на самотек, а держится под контролем.

Рис. 2. Два варианта починки ДНК (рисунок автора)
Рис. 2. Два варианта починки ДНК (рисунок автора)

Системы починки ДНК видят одноцепочечный разрыв ДНК и стремятся его починить, но у них есть два варианта действий (отмечены звездочками на рис. 2): с восстановлением искомой последовательности (на рисунке слева) или с добавлением новой (справа). В сторону новой последовательности клетку быстро склоняет фермент под названием эндонуклеаза FEN1, которая охотится за свободно болтающимися хвостами ДНК и разрушает их. Нить ДНК имеет направление, и эндонуклеаза умеет откусывать только с одного ее конца. Расчет ученых сделан на то, что этим концом окажется старый участок ДНК. После того как старый кусок ДНК был съеден эндонуклеазой, у клеточной системы починки не остается выбора — и она зашивает разрыв с включением новой последовательности.

Второй шаг — исправление комплементарной цепи — тоже проходит при помощи клеточных систем починки ДНК под контролем исследователей. Новый участок ДНК не полностью комплементарен второй цепи, и клетка пытается это тоже исправить. Перед ней встает новый выбор: какую из цепей взять за образец — отредактированную или нетронутую? Для того чтобы ввести клетку в заблуждение и заставить ее исправить цепь с исходным кодом, ученые идут на хитрость. При помощи того же мутантного фермента Cas9 и образца РНК они делают новый надрез, на этот раз в нетронутой цепи. Это кардинально влияет на клеточный выбор: она расценивает этот надрез как источник ошибки и исправляет его по примеру целой цепи — с уже отредактированным участком.

Несмотря на внешнюю сложность манипуляций, этот метод — по словам его авторов — гораздо аккуратнее и эффективнее предыдущего: в зависимости от клеточных линий, на которых проверяли метод, и от размера вставки количество удачно отредактированных участков варь­ировало от 20 до 50%, а количество ошибок колебалось в пределах 10%.

Авторы исследования проверили новый метод на разных типах вставок. Всего они провели более 175 «операций» по исправлению геномов клеточных линий, среди которых были как однобуквенные, так и более крупные вставки, замены и удаления в пределах нескольких десятков букв. По их словам, данным методом можно исправить примерно 89% всех известных вариантов ДНК, связанных с генетическими заболеваниями.

Конечно, новому методу еще предстоит всесторонняя проверка другими исследовательскими группами, но уже сейчас он выглядит очень перспективно. В отличие обычного CRISPR/Cas он по минимуму использует клеточные системы починки, а если и пользуется ими, то берет только аккуратные и контролирует их работу.

Вера Мухина,
сотр. УНЦ «Биоинформатика» ИППИ РАН

  1. Anzalone A. V., Randolph P. B., Davis J. R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Связанные статьи

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Оценить: 
Звёзд: 1Звёзд: 2Звёзд: 3Звёзд: 4Звёзд: 5 (2 оценок, среднее: 4,00 из 5)
Загрузка...
 
 

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: