Одиночные молекулы и преодоление дифракционного предела в оптической микроскопии

Андрей Наумов

Андрей Нау­мов

При­суж­де­ние Нобе­лев­ской пре­мии по химии 2014 года ком­мен­ти­ру­ет Андрей Нау­мов, докт. физ.-мат. наук, Инсти­тут спек­тро­ско­пии РАН (Тро­ицк), Мос­ков­ский педа­го­ги­че­ский госу­дар­ствен­ный уни­вер­си­тет (Москва), www.isan.troitsk.ru/~naumov

Нобе­лев­ская пре­мия по химии 2014 года при­суж­де­на Уилья­му Мёр­не­ру (Стэн­форд­ский уни­вер­си­тет, США), Эри­ку Бет­ци­гу (Меди­цин­ский инсти­тут Говар­да Хью­за, США) и Ште­фа­ну Хел­лю (Инсти­тут Мак­са План­ка в Гей­дель­бер­ге, Гер­ма­ния) за раз­ви­тие мето­дов флу­о­рес­цент­ной мик­ро­ско­пии сверх­вы­со­ко­го раз­ре­ше­ния.

Опти­че­ская мик­ро­ско­пия при­над­ле­жит к чис­лу ста­рей­ших экс­пе­ри­мен­таль­ных мето­дов, сохра­нив­ших свою высо­кую зна­чи­мость во мно­гих науч­ных дис­ци­пли­нах. Начи­ная с рабо­ты Аббе 1873 года [1] ста­ло ясно, что про­стран­ствен­ное раз­ре­ше­ние даль­не­по­ле­во­го мик­ро­ско­па, осно­ван­но­го на фоку­си­ру­ю­щей опти­ке, име­ет пре­дел, кото­рый опре­де­ля­ет­ся дифрак­ци­ей и состав­ля­ет при­мер­но 12 дли­ны вол­ны реги­стри­ру­е­мо­го излу­че­ния (т.е. в види­мой обла­сти спек­тра ~200–300 нм).

Конеч­но, к насто­я­ще­му вре­ме­ни раз­ра­бо­тан целый ряд мето­дов, поз­во­ля­ю­щих вос­ста­но­вить суб­ди­фрак­ци­он­ную струк­ту­ру мате­ри­а­ла: элек­трон­ная, атом­но-сило­вая, ближ­не­по­ле­вая ска­ни­ру­ю­щая, рент­ге­нов­ская мик­ро­ско­пия… Одна­ко каж­дый из этих мето­дов обла­да­ет прин­ци­пи­аль­ны­ми недо­стат­ка­ми, затруд­ня­ю­щи­ми их широ­кое исполь­зо­ва­ние для нано­ди­а­гно­сти­ки струк­ту­ры и дина­ми­ки образ­цов, осо­бен­но в тех слу­ча­ях, когда речь идет об опе­ра­тив­но­сти иссле­до­ва­ния, про­сто­те про­це­ду­ры изме­ре­ния, необ­хо­ди­мо­сти диа­гно­сти­ки струк­ту­ры и дина­ми­ки объ­ек­та, его поверх­но­сти и объ­е­ма.

Раз­ви­тие мето­дов лазер­ной флу­о­рес­цент­ной мик­ро­ско­пии поз­во­ли­ло иссле­до­ва­те­лям пре­одо­леть (имен­но пре­одо­леть, а не «отме­нить») клас­си­че­ский дифрак­ци­он­ный пре­дел в опти­че­ской мик­ро­ско­пии.

Оди­ноч­ные моле­ку­лы

Пер­вая груп­па мето­дов опти­че­ской «нано­ско­пии» осно­ва­на на детек­ти­ро­ва­нии оди­ноч­ных флу­о­рес­ци­ру­ю­щих моле­кул. Для реа­ли­за­ции этой идеи нуж­но добить­ся раз­дель­но­го (селек­тив­но­го) детек­ти­ро­ва­ния отдель­ных моле­кул, т. е. перей­ти от реги­стра­ции одно­вре­мен­но­го све­че­ния огром­но­го ансам­бля моле­кул к пре­дель­но малым кон­цен­тра­ци­ям и далее к оди­ноч­ным моле­ку­лам (ОМ).

Здесь нуж­но отме­тить осно­во­по­ла­га­ю­щий вклад оте­че­ствен­ных уче­ных в раз­ви­тие спек­тро­ско­пии орга­ни­че­ских моле­кул. Актив­ные рабо­ты по изу­че­нию люми­нес­цен­ции рас­тво­ров про­во­ди­лись в лабо­ра­то­рии люми­нес­цен­ции ФИАН под руко­вод­ством С. И. Вави­ло­ва, а в 1952 году сотруд­ни­ки кафед­ры тео­ре­ти­че­ской физи­ки Мос­ков­ско­го госу­дар­ствен­но­го педа­го­ги­че­ско­го инсти­ту­та под руко­вод­ством Э.В. Шполь­ско­го впер­вые наблю­да­ли эффект воз­ник­но­ве­ния ква­зи­ли­ней­ча­тых спек­тров слож­ных орга­ни­че­ских соеди­не­ний в спе­ци­аль­но подо­бран­ных рас­тво­ри­те­лях при низ­ких тем­пе­ра­ту­рах. При крио­ген­ных тем­пе­ра­ту­рах спек­тры внед­рен­ных моле­кул, жест­ко зафик­си­ро­ван­ных в про­зрач­ных мат­ри­цах, ста­но­вят­ся очень узки­ми. Тогда появ­ля­ет­ся воз­мож­ность воз­буж­дать, застав­лять све­тить­ся не все моле­ку­лы, а их отдель­ные ансам­бли. В 1972 году уче­ник Шполь­ско­го про­фес­сор Р.И. Пер­со­нов с кол­ле­га­ми доби­лись в Инсти­ту­те спек­тро­ско­пии АН СССР успе­ха по селек­тив­но­му лазер­но­му воз­буж­де­нию све­че­ния орга­ни­че­ских моле­кул. Затем в 1974 году лабо­ра­то­рия Пер­со­но­ва и его кол­ле­ги из Инсти­ту­та физи­ки в Тар­ту про­ве­ли пио­нер­ские опы­ты по «выжи­га­нию спек­траль­ных про­ва­лов», когда с помо­щью лазе­ра часть моле­кул «пере­во­ди­лась в безыз­лу­ча­тель­ное состо­я­ние», не све­ти­лась. Эти рабо­ты лег­ли в осно­ву направ­ле­ния селек­тив­ной лазер­ной спек­тро­ско­пии моле­кул, куль­ми­на­ци­он­ным дости­же­ни­ем кото­ро­го ста­ла спек­тро­ско­пия оди­ноч­ных моле­кул (СОМ) [2].

В 1989 году У. Мёр­нер и Л. Кадор про­де­мон­стри­ро­ва­ли воз­мож­ность реги­стра­ции спек­тров погло­ще­ния ОМ [3], а спу­стя все­го несколь­ко меся­цев М. Оррит и Дж. Бер­нард убе­ди­тель­но дока­за­ли в экс­пе­ри­мен­те воз­мож­ность детек­ти­ро­ва­ния флу­о­рес­цент­но­го све­че­ния ОМ в твер­дой мат­ри­це при крио­ген­ных тем­пе­ра­ту­рах [4]. За 25 лет, про­шед­ших с пер­вых экс­пе­ри­мен­тов, дан­ное направ­ле­ние интен­сив­но раз­ви­ва­лось и ста­ло одним из наи­бо­лее акту­аль­ных в физи­че­ской химии, био­фи­зи­ке и смеж­ных нау­ках. Всё воз­рас­та­ю­щий инте­рес к СОМ обу­слов­лен рядом при­чин:

  1. Физи­ко-хими­че­ские свой­ства веще­ства могут быть иссле­до­ва­ны на мини­маль­но воз­мож­ном уровне — на уровне отдель­ных моле­кул.
  2. Опти­че­ские спек­тры и спек­траль­ная дина­ми­ка ОМ, внед­рен­ных в изу­ча­е­мую сре­ду (жид­кость, твер­дое тело) в каче­стве нано­зон­дов, содер­жат бес­пре­це­дент­но бога­тую инфор­ма­цию как о самих излу­ча­те­лях, так и о пара­мет­рах бли­жай­ше­го окру­же­ния.
  3. Реги­стра­ция люми­нес­цент­ных изоб­ра­же­ний оди­ноч­ных точеч­ных излу­ча­те­лей в схе­ме ска­ни­ру­ю­ще­го кон­фо­каль­но­го мик­ро­ско­па или клас­си­че­ско­го люми­нес­цент­но­го мик­ро­ско­па с 2D-детек­то­ром поз­во­ля­ет рекон­стру­и­ро­вать коор­ди­на­ты ОМ с суб­ди­фрак­ци­он­ной (нано­мет­ро­вой) точ­но­стью.

Мик­ро­ско­пия с рекон­струк­ци­ей изоб­ра­же­ний оди­ноч­ных моле­кул

Фото­ны люми­нес­цен­ции ОМ фор­ми­ру­ют на 2D-детек­то­ре изоб­ра­же­ние точеч­но­го источ­ни­ка све­та. Ана­лиз изоб­ра­же­ния ОМ с уче­том опре­де­лен­ной фор­мы аппа­рат­ной функ­ции точеч­но­го источ­ни­ка поз­во­ля­ет опре­де­лить поло­же­ние (коор­ди­на­ты) ОМ с погреш­но­стью, кото­рая огра­ни­че­на толь­ко ста­биль­но­стью уста­нов­ки, отно­ше­ни­ем «сиг­нал — шум» реги­стри­ру­е­мо­го излу­че­ния и раз­ме­ра­ми само­го точеч­но­го источ­ни­ка, и может суще­ствен­но пре­вос­хо­дить дифрак­ци­он­ный пре­дел (рис. 1).

Рис. 1. (а) Аппаратная функция идеального точечного источника света. (б) Типичный пример флуоресцентного изображения ОМ (террилен) в полимерной пленке при резонансном лазерном возбуждении в области l = 575 нм при температуре 4,3 K. В простейшем случае относительные поперечные координаты молекулы могут быть рассчитаны нахождением «центра тяжести» изображения (centroid approximation): xc = 22,3 мкм; yc = 32,3 мкм. (в) Определение поперечных координат молекулы путем аппроксимации изображения двумерной функцией Гаусса: xc = 22 мкм 240 нм ± 40 нм; yc = 32 мкм 350 нм ± 30 нм.

Рис. 1. (а) Аппа­рат­ная функ­ция иде­аль­но­го точеч­но­го источ­ни­ка све­та. (б) Типич­ный при­мер флу­о­рес­цент­но­го изоб­ра­же­ния ОМ (тер­ри­лен) в поли­мер­ной плен­ке при резо­нанс­ном лазер­ном воз­буж­де­нии в обла­сти l = 575 нм при тем­пе­ра­ту­ре 4,3 K. В про­стей­шем слу­чае отно­си­тель­ные попе­реч­ные коор­ди­на­ты моле­ку­лы могут быть рас­счи­та­ны нахож­де­ни­ем «цен­тра тяже­сти» изоб­ра­же­ния (centroid approximation): xc = 22,3 мкм; yc = 32,3 мкм. (в) Опре­де­ле­ние попе­реч­ных коор­ди­нат моле­ку­лы путем аппрок­си­ма­ции изоб­ра­же­ния дву­мер­ной функ­ци­ей Гаус­са: xc = 22 мкм 240 нм ± 40 нм; yc = 32 мкм 350 нм ± 30 нм.

В то же вре­мя зада­чи диа­гно­сти­ки про­тя­жен­ных объ­ек­тов, как пра­ви­ло, тре­бу­ют детек­ти­ро­ва­ния зна­чи­тель­но­го коли­че­ства ОМ и их высо­кой про­стран­ствен­ной плот­но­сти. В этом слу­чае одно­вре­мен­ное све­че­ние тысяч моле­кул не поз­во­ля­ет раз­ли­чить изоб­ра­же­ния оди­ноч­ных точеч­ных источ­ни­ков — иден­ти­фи­ка­ция и опре­де­ле­ние точ­ных поло­же­ний ОМ ста­но­вят­ся невоз­мож­ны­ми. Обой­ти это затруд­не­ние воз­мож­но, если раз­ные ОМ излу­ча­ют в раз­ные момен­ты вре­ме­ни, либо раз­ли­чая ОМ, нахо­дя­щи­е­ся внут­ри обще­го дифрак­ци­он­но­го пре­де­ла по допол­ни­тель­но­му при­зна­ку или свой­ству [5].

Суще­ству­ет несколь­ко мето­дов, поз­во­ля­ю­щих реа­ли­зо­вать эту идею. Наи­боль­шее рас­про­стра­не­ние к насто­я­ще­му вре­ме­ни полу­чи­ла тех­ни­ка, в осно­ве кото­рой лежит явле­ние мер­ца­ния флу­о­рес­цен­ции оди­ноч­ных кван­то­вых объ­ек­тов. Слу­чай­ное пре­ры­ва­ние флу­о­рес­цен­ции отдель­ных моле­кул про­ис­хо­дит в раз­ные момен­ты вре­ме­ни. Таким обра­зом, при доста­точ­но низ­кой кон­цен­тра­ции при­мес­ных моле­кул в каж­дый момент вре­ме­ни внут­ри каж­до­го дифрак­ци­он­но огра­ни­чен­но­го объ­е­ма образ­ца люми­нес­ци­ру­ет толь­ко одна моле­ку­ла, что и поз­во­ля­ет заре­ги­стри­ро­вать ее изоб­ра­же­ние и, как след­ствие, коор­ди­на­ты. Эта идея была реа­ли­зо­ва­на в тех­ни­ке photoactivation localization microscopy (PALM) кол­лек­ти­вом под руко­вод­ством Э. Бет­ци­га [6]. Сле­ду­ет отме­тить, что при­мер­но в это же вре­мя успеш­но раз­ви­ва­лась осно­ван­ная на тех же прин­ци­пах тех­ни­ка stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) [7]. В самые послед­ние годы были раз­ра­бо­та­ны ори­ги­наль­ные мето­ды визу­а­ли­за­ции ОМ, кото­рые поз­во­ля­ют опре­де­лять с нано­мет­ро­вой точ­но­стью все три коор­ди­на­ты точеч­но­го излу­ча­те­ля [8, 9].

Мик­ро­ско­пия с подав­ле­ни­ем спон­тан­но­го излу­че­ния

Парал­лель­но с «одно­мо­ле­ку­ляр­ны­ми» мето­ди­ка­ми в сере­дине 2000-х успеш­но раз­ви­ва­лась вто­рая груп­па мето­дов опти­че­ской нано­ско­пии, осно­ван­ных на мани­пу­ли­ро­ва­нии с пара­мет­ра­ми воз­буж­да­ю­ще­го излу­че­ния и нели­ней­ным откли­ком иссле­ду­е­мой сре­ды. Спе­ци­фи­че­ский под­бор пара­мет­ров воз­буж­да­ю­ще­го лазер­но­го излу­че­ния поз­во­ля­ет суще­ствен­но умень­шить харак­тер­ные раз­ме­ры аппа­рат­ной функ­ции мик­ро­ско­па. В част­но­сти, в раз­ра­бо­тан­ной Ш.Хеллем тех­ни­ке stimulated emission depletion (STED) [5], эффек­тив­ный объ­ем мате­ри­а­ла, из кото­ро­го реги­стри­ру­ет­ся флу­о­рес­цен­ция, умень­ша­ет­ся за счет пере­во­да в безыз­лу­ча­тель­ное (на рабо­чей длине вол­ны) состо­я­ние части моле­кул по кра­ям пят­на засвет­ки сфо­ку­си­ро­ван­но­го лазер­но­го излу­че­ния. Обед­не­ние флу­о­рес­цен­ции дости­га­ет­ся за счет вто­ро­го лазе­ра с задан­ным попе­реч­ным про­фи­лем пуч­ка. В дан­ном слу­чае при­хо­дит­ся исполь­зо­вать тех­ни­ку ска­ни­ру­ю­щей кон­фо­каль­ной мик­ро­ско­пии, одна­ко базис тех­ни­ки всё тот же — в слу­чае, когда реги­стри­ру­ет­ся излу­че­ние от агло­ме­ра­ции моле­кул с раз­ме­ра­ми, суще­ствен­но мень­ше дли­ны вол­ны све­та, воз­мож­но опре­де­ле­ние коор­ди­нат этой груп­пы моле­кул с суб­ди­фрак­ци­он­ной точ­но­стью.

Рис. 2. Примеры реализации методов STED и PALM (справа) в сравнении с классическими методами микроскопии (слева) при визуализации клеток млекопитающих.

Рис. 2. При­ме­ры реа­ли­за­ции мето­дов STED и PALM (спра­ва) в срав­не­нии с клас­си­че­ски­ми мето­да­ми мик­ро­ско­пии (сле­ва) при визу­а­ли­за­ции кле­ток мле­ко­пи­та­ю­щих.

При­ме­не­ния и пер­спек­ти­вы

На осно­ве мето­дов STED, PALM, STORM были созда­ны пер­вые ком­мер­че­ские опти­че­ские «нано­ско­пы» — мик­ро­ско­пы сверх­вы­со­ко­го раз­ре­ше­ния, обо­ру­до­ван­ные лазер­ны­ми источ­ни­ка­ми, уль­тра­чув­стви­тель­ны­ми детек­то­ра­ми и мощ­ны­ми ком­пью­те­ра­ми, кото­рые поз­во­ля­ют быст­ро рас­по­зна­вать и вос­ста­нав­ли­вать изоб­ра­же­ния. Раз­ра­бо­тан­ные мето­ды и инстру­мен­ты уже ока­за­лись широ­ко вос­тре­бо­ва­ны в био­хи­мии, био­фи­зи­ке и смеж­ных нау­ках, а так­же откры­ва­ют новые пер­спек­ти­вы в обла­сти нано­сен­со­ри­ки, меди­цин­ской физи­ки, мате­ри­а­ло­ве­де­ния, кван­то­вой опти­ки и нано­тех­но­ло­гий (см. ста­тью-кол­ло­кви­ум [9]). В этой свя­зи есть все осно­ва­ния пола­гать, что Нобе­лев­ская пре­мия 2014 года — дале­ко не послед­няя в чере­де ярких под­твер­жде­ний потен­ци­а­ла это­го направ­ле­ния нау­ки.

1. Abbe, Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung /​/​ Archiv für Mikroskopische Anatomie, 9 (1), 413–418 (1873).

2. А.В. Нау­мов, «Спек­тро­ско­пия орга­ни­че­ских моле­кул в твёр­дых мат­ри­цах при низ­ких тем­пе­ра­ту­рах: от эффек­та Шполь­ско­го к лазер­ной люми­нес­цент­ной спек­тро­мик­ро­ско­пии всех эффек­тив­но излу­ча­ю­щих оди­ноч­ных моле­кул» /​/​ Успе­хи Физи­че­ских Наук, 183 (6), 633–652 (2013).

3. E. Moerner, L. Kador, Optical-Detection and Spectroscopy of Single Molecules in a Solid /​/​ Physical Review Letters, 62 (21), 2535–2538 (1989).

4. Orrit, J. Bernard, Single pentacene molecules detected by fuorescence excitation in para-terphenyl crystal /​/​ Physical Review Letters, 65 (21), 2716–2719 (1990).

5. W. Hell, Far-feld optical nanoscopy /​/​ Science, 316 (5828), 1153–1158 (2007).

6. E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess, Imaging intracellular fuorescent proteins at nanometer resolution /​/​ Science, 313 (5793), 1642–1645 (2006).

7. J. Rust, M. Bates, X.W. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) /​/​ Nature Methods, 3 (10), 793–795 (2006).

8. R.P. Pavani, M.A. Thompson, J.S. Biteen, S.J. Lord, N. Liu, R.J. Twieg, R. Piestun, W.E. Moerner, Three-dimensional, single-molecule fuorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function /​/​ Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106 (9), 2995–2999 (2009).

9. V. Naumov, I.Y. Eremchev, A.A. Gorshelev, Laser Selective Spectromicroscopy of Myriad Single Molecules: Tool for Far-Field Multicolor Materials Nanodiagnostics /​/​ European Physical Journal D, Colloquium paper (in print) DOI: 10.1140/epjd/e2014-50414-x (2014).

Если вы нашли ошиб­ку, пожа­луй­ста, выде­ли­те фраг­мент тек­ста и нажми­те Ctrl+Enter.

Связанные статьи

Оценить: 
Звёзд: 1Звёзд: 2Звёзд: 3Звёзд: 4Звёзд: 5 (Пока оценок нет)
Загрузка...
 
 

Метки: , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

 

2 комментария

  • Григорий Машанов:

    Доб­рый день! Тема рас­кры­та лишь частич­но. Пол­но­стью отсут­ству­ет кри­ти­че­ская оцен­ка мето­дов. Преж­де все­го, оба мето­да тре­бу­ют зна­чи­тель­но­го вре­ме­ни на постро­е­ние одно­го изоб­ра­же­ния – сле­до­ва­тель­но не при­год­ны для изу­че­ния дина­ми­ки оди­ноч­ных моле­кул в живых клет­ках, мно­гие собы­тия на уровне отдель­ных моле­кул про­ис­хо­дят за доли секун­ды. Чаще все­го при­ме­ры при­ме­не­ния PALM и STORM огра­ни­че­ны рекон­струк­ци­ей сети мик­ро­тру­бо­чек – имен­но из мед­лен­ной дина­ми­ки этих струк­тур. Пото­му то автор и не смог ниче­го ска­зать в раз­де­ле «При­ме­не­ния и пер­спек­ти­вы». Кро­ме опи­сан­ных мето­дов суще­ству­ют дру­гие мето­ды при­жиз­нен­ной мик­ро­ско­пии оди­ноч­ных моле­кул, кото­рые поз­во­ля­ют опре­де­лять дви­жу­щих­ся моле­кул с точ­но­стью 5–20нм.
    С ува­же­ни­ем
    Гри­го­рий Маша­нов

    • Anton:

      Ну вот как толь­ко эти мето­ды полу­чат Нобе­лев­скую пре­мию, так и про них мож­но будет напи­сать :-)

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Недопустимы спам, оскорбления. Желательно подписываться реальным именем. Аватары - через gravatar.com