Десять лет назад было объявлено о секвенировании (определении последовательности нуклеотидов) генома человека. Это была черновая последовательность, потом появились еще несколько статей про окончательную, самую окончательную и самую-самую окончательную версии; последовательность генома дополняли, исправляли и уточняли. Это был химерный геном, т.е. усредненный по нескольким людям; за два последних года появились несколько индивидуальных геномов и даже отдельные геномы здоровых и раковых клеток одного человека.
А в этом году был опубликован черновой, но достаточно точный для нетривиальных выводов геном неандертальца, представителя другой ветви вида Homo sapiens [1].
Проблемы и решения
Есть четыре основных проблемы при работе с ДНК из археологических источников. Первые две имеют химическую природу. За тысячи лет, когда кости лежат в земле, ДНК в них разрушается, и потому большинство фрагментов очень короткие, их длина — малые десятки. Во-вторых, ДНК подвергается изменениям, и одни нуклеотиды превращаются в другие; последовательность случайным образом меняется. Две другие проблемы — биологические. Лишь малая доля ДНК, выделенной из образца, — это то, что нужно; подавляющая часть (95-99%) — это ДНК почвенных микроорганизмов. И самая серьезная проблема, критически существенная при исследовании древних геномов человека, — это загрязнение современной ДНК. Количество сохранившихся фрагментов ДНК так ничтожно мало, что за время раскопок, пребывания в музее и в лаборатории на кость попадает сравнимое, если не большее, количество ДНК тех, кто с ней работал. Для секвенирования используют внутренние части кости, извлекая их в стерильных условиях: это помогает, но не снимает проблему полностью.
Поэтому для доказательства принципиальной возможности секвенировать древнюю ДНК начали не с человека, а с пещерного медведя. В 2005 г. группы Сванте Паабо из Института эволюционной антропологии в Лейпциге и Эдди Рубина из Объединенного геномного института, расположенного недалеко от Беркли в Калифорнии, секвенировали и опубликовали фрагменты общей длиной 27 тыс. нуклеотидов из 43-тысячелетнего зуба, найденного в пещере в Австрии [2]. Сопоставление с известными последовательностями показало, что они действительно принадлежат близкому родственнику современных медведей. Ну, а поскольку до этого в лаборатории никогда не работали с образцами ДНК представителей отряда хищных, вопрос загрязнения был решен сам собой.
Для борьбы с микробным загрязнением были разработаны специальные методы, уменьшающие долю таких фрагментов. Основная же нагрузка при этом ложится на вычислительные методы: в работу заведомо не берут последовательности, похожие на известные последовательности микроорганизмов, а также последовательности неизвестного происхождения, т.е., в конечном счете используют только фрагменты, происхождение которых можно достоверно установить межгеномными сравнениями. Пока это единственный выход, но это означает, что мы не можем анализировать уникальные фрагменты или геномы живых существ, не имеющих современных близких родственников.
При работе с ДНК человека критической проблемой является загрязнение современной ДНК — от археологов, которые извлекали кости из земли; антропологов, которые их описывали; молекулярных биологов, которые выделяли ДНК; да и просто молекулами ДНК из лабораторного воздуха. Когда в 2006 г. группы Паабо и Рубина опубликовали первые статьи про ядерный геном неандертальца, сделанные разными методами на одном материале из пещеры Виндия в Хорватии [3, 4], было замечено, что их выводы отчасти противоречат друг другу [5]. Впоследствии оказалось, что до 40% последовательностей, полученных тогда группой Паабо, — это современная ДНК.
Однако исследования продолжались. Оказалось, что даже проблемы можно превратить в орудие работы: те самые химические изменения, произошедшие за тысячи лет, можно использовать как признак, отличающий древнюю ДНК от современной. Делается это вычислительно: фрагменты предполагаемой ДНК неандертальца сопоставляют с геномом современного человека (кроманьонца) и считают различия.
Дело в том, что эти химические изменения — не произвольные замены, а совершенно конкретные: C-T и G-A. Соответственно, оценка количества таких замен (до 6% нуклеотидов для исследованных образцов примерно 38-тысячелетней давности) по сравнению с другими заменами и с соотношением, ожидаемым из известных частот «нормальных» биологических мутаций, позволяет оценить долю настоящей древней ДНК в полученной выборке. Изменения происходят независимо в каждой индивидуальной молекуле, а при большом объеме данных каждый нуклеотид бывает прочитан много раз в составе разных фрагментов. Поэтому даже при значительной частоте химических изменений простым «голосованием» фрагментов можно узнать, действительно ли мы имеем дело с отличием исследуемого генома от эталонного или это результат этих изменений.
Геном и гены
Один из первых содержательных выводов новой статьи группы Паабо: исследуемая кость принадлежала женщине (как правильно говорить про наших ближайших родственников неандертальцев -не «самка» же?). Это следовало из того, что лишь считанные фрагменты совпали с участками Y-хромосомы (имеющейся только в мужском геноме): при таком объеме данных для мужского генома ожидалось бы около 500 фрагментов Y-хромосомы. Кстати, это стало еще одним косвенным свидетельством отсутствия заметного загрязнения современной ДНК, в предыдущей работе именно такое загрязнение привело к тому, что та же кость была приписана мужчине.
Для более точной оценки доли загрязнения были разработаны специальные вычислительные методы, основанные на сравнении различий между геномами различных кроманьонцев (т.е. представителей различных этнических групп современного человека), с отличиями их от геномов неандертальца и шимпанзе. Оказалось, что загрязнение составляет не более 1%.
Дальше начались собственно исследования. Отличия генома неандертальца от генома кроманьонца составили 12% от разницы между геномами человека и шимпанзе. Тем самым, если принять, что человек и шимпанзе разошлись 6,5 млн лет назад, наше расхождение с неандертальцем началось примерно 800 тыс. лет назад. Однако авторы отмечают, что этот вывод основан на допущении (видимо, правильном) о равенстве и примерном постоянстве скоростей молекулярной эволюции и на палеонтологических данных (не очень точных) о том, когда жил последний общий предок человека и шимпанзе.
Кроме того, следует учесть, что если взять два индивидуальных генома, среднее время их расхождения будет больше, чем время расхождения соответствующих видов (т.е. время от момента, когда прекратился массовый поток генетической информации между популяциями) в силу сложной структуры любой природной популяции. Для сравнения, для пар кроманьонцев из разных популяций средний уровень различий составил примерно 8-10% от различий человек-шимпанзе. Время же «настоящего» расхождения кроманьонца и неандертальца, оцененное с использованием различных популяционных моделей, составило 270-440 тыс. лет. Эти же данные были подтверждены при секвенировании образцов из Эль-Сидрона в Испании, пещеры Межмайская на Кавказе и из самой долины Неандерталь в Германии, несмотря на то, что материал из Межмайской на 20-30 тыс. лет старше, чем из других мест.
Наличие трех геномов — кроманьонца, неандертальца и шимпанзе позволило найти изменения, которые произошли и зафиксировались в геноме современного человека уже после разделения с неандертальцем: для этого достаточно рассмотреть тройки нуклеотидов, которые одинаковы у неандертальца и шимпанзе и отличаются у всех исследованных кроманьонцев. Мутации, меняющие колируемый белок, были найдены в 73 генах; авторы не исследовали потенциальные регуляторные мутации, поскольку не ясно, как отличать их от незначимых изменений.
Несколько белковых мутаций произошло в генах, влияющих на цвет кожи и волос. Еще раньше было показано, что неандертальцы, как и европейцы, были светлокожими, однако за счет других мутаций [6].
Таким образом, это приспособление к жизни в средних широтах произошло у неандертальцев и кроманьонцев независимо. Произошли изменения в шести рецепторах запахов (известно, что эти гены эволюционируют очень быстро) и в одном гене, играющем ключевую роль в восприятии вкуса.
Были выделены участки ДНК, которые не просто меняются, но, видимо, несут полезные изменения. Дело в том, что отбор в такой области быстро фиксирует новый вариант, и потому разнообразие генома (при сравнении разных индивидуумов) в ней уменьшено. Этот подход используется давно, но геном неандертальца позволил выбрать области, где отбор действовал уже после расхождения неандертальцев и кроманьонцев, т.е. был специфичен именно для современного человека. Среди таких областей — район гена THADA, связанного с энергетическим обменом; известно, что мутации в области этого гена вызывают предрасположенность к диабету.
Предыстория
Но, пожалуй, самым интересным результатом статьи стало то, что есть участки генома (1-4%), общие для неандертальцев и современных европейцев и азиатов, но отсутствующие в геномах африканцев. Это означает, что после выхода кроманьонцев из Африки, датируемого примерно 100 тыс. лет назад, они смешивались с неандертальцами, и следы этого остались в наших генах. То, что таких следов нет в геномах африканцев, указывает, что это именно неандертальская примесь в евроазиатских геномах, а не наоборот. Более того, это произошло уже после разделения ветвей кроманьонцев, пошедших в Европу и в Азию. В соответствии с археологическими данными самый вероятный сценарий — контакт между неандертальцами и кроманьонцами на Ближнем Востоке 100-50 тыс. лет назад.
Более подробные сценарии будут разрабатываться по мере появления новых данных. Есть надежда, что удастся различить генетический вклад самого древнего населения Европы и поздних волн миграции, связанных с распространением земледелия. Например, разработанные методы фильтрации загрязнений помогли установить последовательность митохондриальной ДНК из скелета раннего кроманьонца со стоянки Костёнки-14, жившего 30 тыс. лет назад на территории современной Воронежской области (митохондрии — небольшие органеллы, присутствующие в большом количестве в каждой клетке и имеющие свой собственный небольшой геном, поэтому количество митохондриальной ДНК в древних образцах существенно больше, чем ядерной, и ее легче секвенировать: уже известны митохондриальные геномы шести неандертальцев) [7].
С другой стороны, секвенированы митохондриальные геномы 24 представителей первых европейских земледельцев, живших 7,5 тыс. лет назад на территории Германии, Австрии и Венгрии [8]. Сравнение этих геномов с мито-хондриальными геномами 22 охотников и собирателей и с геномами современных людей показало очень слабую генетическую связь: это три разные популяции [9]. А это уже позволяет сделать важный (до)исторический вывод: распространение земледелия происходило путем вытеснения одних популяций другими, а не путем культурного обмена. Однако более детальный анализ будет возможен только после секвенирования ядерных геномов.
А самый удивительный результат, связанный с секвенированием митохондриальной ДНК, — это геном из 40-тысячелетней кости из Денисовой пещеры на Алтае [10]. Судя по количеству отличий в последовательности, он примерно на миллион лет отстоит от геномов неандертальцев и кроманьонцев. Проблема же в том, что непонятно, какой из разновидностей человека этот геном принадлежит. Костных остатков недостаточно для антропологических выводов, а дата расхождения вроде бы получается слишком поздней, чтобы приписать этот геном ближайшему родственнику Homo sapiens — Homo erectus (питекантропу), жившему в Азии после отделения от нашей ветви около 2 млн лет назад (не по геномным, а по антропологическим данным). При этом тогда же на Алтае жили и неандертальцы, и кроманьонцы.
Перспективы
Ясно, что работа с ДНК из ископаемых остатков будет продолжаться и развиваться. Очень хочется узнать геномы «хоббитов» с острова Флорес — еще одной разновидности человека, исчезнувшей всего 13 тыс. лет назад, но надежд на это мало. В условиях тропиков ДНК не сохраняется: нужна или мерзлота, или сухой климат.
Работают и не только с человеческим геномом: несколько лет назад мне по рассылке прислали сообщение: одна западная лаборатория приглашала на работу постдока заниматься популяционной генетикой мамонтов и мастодонтов. Конечно, в этом есть некий налет сенсационности: в конечном счете совершенно не понятно, чем это интереснее, чем популяцион-ная генетика, скажем, слонов (тем более, что продолжаются споры о том, составляют ли две популяции африканских слонов независимые виды). Но вот для понимания происхождения и эволюции человека значимость исследований такого рода трудно переоценить.
Радует, что в исследованиях древней ДНК принимают участие российские ученые. Например, в работе над геномом неандертальца участвовали Владимир Дороничев и Любовь Голованова из АНО «Лаборатория доистории» в Санкт-Петербурге. Материал из Денисовой пещеры предоставили Михаил Шунков и академик РАН Анатолий Деревянко из Института археологии и этнографии СО РАН. А.П. Деревянко был и в числе соавторов статьи про митохондриальный геном из Костёнок-14. Правда, всё это — не молекулярные биологи и биохимики, а археологи и палеонтологи.
Как и с нефтью, Россия пока поставляет «сырье», и — как и с нефтью — кажется, что иногда возникает ситуация получения ренты от вложений, сделанных очень давно. Скажем, скелет из Костёнок-14 был откопан еще в 1954 г. [11], и потому не вполне ясно, в чем состояла роль единственного российского соавтора статьи, директора Института археологии и этнографии СО РАН, родившегося в 1943 г.: неужели только в получении разрешения использовать музейный материал?
Хорошая новость: в обширных районах вечной мерзлоты материала для анализа древней ДНК — тех же мамонтов — много. С появлением в России современных технологий секвенирования это географическое преимущество может быть использовано в полной мере. Первые шаги уже делаются: насколько мне известно, три российские группы работают над исследованием ДНК из останков мамонта.
Михаил Гельфанд,
докт. биол. наук,
профессор факультета
биоинженерии и биоинформатики МГУ
1. Green RE et al. Draft sequence of the Neandertal genome // Science 328: 710 (2010).
2. Noonan JP et al. Genomic sequencing of Pleistocene cave bears // Science 309: 597 (2005).
3. Green RE. Analysis of one million base pairs of Neanderthal DNA // Nature 444: 330 (2006).
4. Noonan JP et al. Sequence and analysis of Neanderthal genomic DNA // Science 314: 1113 (2006).
5. Wall DJ and Kim SK. Inconsistencies in Neanderthal genomic DNA sequences // PLoS Genetics 3: 1862 (2007).
6. Lalueza-Fox C et al. A melanocortin 1 receptor allele suggests varying pigmentation among Neanderthals // Science 318: 1453 (2007).
7. Krause J et al. A complete mtDNA genomes of an early modern human from Kostenki, Russia // Current Biology 20: 231 (2010).
8. Haak W et al. Ancient DNA from the first European farmers in 7500-year-old Neolithic sites // Science 310: 1016 (2005).
9. Bramanti B. et al. Genetic discontinuity between local hunter-gatherers and Central Europe’s first farmers // Science 326: 137 (2009).
10. Krause J et al. The complete mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia // Nature 464: 894 (2010).
11. Рогачев А.Н. Погребение древнекаменного века на стоянке Костёнки XIV (Маркина гора) // Советская этнография № 1: 29 (1955).